Shrimp alkaline phosphatase protocol

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Performances éprouvées – la référence en matière de phosphatase•100 % inactivé par la chaleur en 15 min à 65°C•Nette amélioration Afficher plus

Shrimp Alkaline Phosphatase, 1000 Units, 1 unit/μL Concentration, Tested for Contaminating Endonucleases, Exonucleases, and Ribonucleases

Performances éprouvées – la référence en matière de phosphatase
•100 % inactivé par la chaleur en 15 min à 65°C
•Nette amélioration de la stabilité du stockage à des températures plus basses (voir fig. 1 et 2)
•Activité spécifique très élevée (voir fig. 3)
•Élimine les 5’-phosphates de l’ADN, de l’ARN, des dNTP et des protéines
•Purifié à partir d’une source recombinante
•Peut être ajouté directement aux digestions par enzymes de restriction
•Aucune purification vectorielle n’est nécessaire
•Ne nécessite pas de zinc supplémentaire ni d’autres additifs pour l’activité
•Fonctionne directement dans un grand nombre de tampons différents
•Traitement facile des dNTP non incorporés dans les produits de PCR avant le séquençage de l’ADN ou l’analyse de SNP

Phosphatase alcaline de crevette (SAP) USB
La phosphatase alcaline de crevette (SAP) est une phosphatase alcaline thermolabile de haute activité spécifique, la phosphatase alcaline thermolabile, purifiée à partir d’une source recombinante et initialement isolée à partir de Pandalus borealis (crevette arctique). La phosphatase alcaline de crevette (SAP) est utile dans de nombreuses applications de biologie moléculaire telles que la déphosphorylation des extrémités phosphorylées de l’ADN ou de l’ARN pour une utilisation ultérieure dans le clonage ou le marquage final des sondes. Lors du clonage, la déphosphorylation empêche la religature de l’ADN plasmidique linéarisé. La SAP peut également être utilisée pour traiter les dNTP non incorporés dans les réactions PCR afin de préparer les modèles pour le séquençage de l’ADN ou l’analyse de SNP.

La phosphatase alcaline de crevette a approximativement la même activité spécifique que la phosphatase alcaline intestinale de veau (CIAP) ; comme la CIAP, elle est active dans pratiquement tous les tampons de réaction des enzymes de restriction. Contrairement à la CIAP, la phosphatase alcaline de crevette est totalement et irréversiblement inactivée par le traitement thermique des réactions à 65°C pendant 15 minutes.

La phosphatase alcaline de crevette est particulièrement utile dans la préparation des produits PCR pour les applications impliquant le séquençage, l’analyse de SNP ou les méthodes de marquage. Généralement, les dNTP excédentaires qui subsistent après la PCR interfèrent avec les réactions enzymatiques ultérieures impliquant la synthèse de l’ADN. La SAP déphosphoryle tous les dNTP restants du mélange PCR en une seule étape facile.

Nous avons le plaisir de vous proposer une version recombinante de notre phosphatase de référence. La SAP recombinante élimine la dépendance à l’égard de l’approvisionnement en matières premières animales et permet de bénéficier d’une stabilité de stockage et d’une cohérence de lot à lot élevées, tout en offrant une activité enzymatique exceptionnelle ainsi qu’une inactivation thermique à 100 %.

Propriétés :
Poids moléculaire : Homodimère. Le monomère est de 55 kDa, tel que déterminé par la séquence amino-acide.
pH optimum : 10,4 dans le tampon glycine et pH de 8,0 dans le tampon TRIS.
Température optimale : 37°C
Inactivation thermique : 65°C pendant 15 minutes
Inhibiteurs : 10 mM de DTT, 0,1 % de β-ME
Conditions de réactions : Active dans NaCl, KCl. Requiert du Mg 2+ pour une activité maximale.

Source :
Recombinant

Pureté :
Testé pour détecter les endonucléases, exonucléases et ribonucléases contaminantes.

Tampon de stockage :
25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM MgCl2, glycérol 50 %.

Conditions de dosages :
Le mélange de réaction contient 100 mM glycine, pH 10,4, 1 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl ₂, 10 mM para-nitrophénylphosphate et 0,001 à 0,1 unités de phosphatase alcaline de crevette (SAP). Surveillance de la variation de l’absorbance à 405 nm (volume de réaction de 3 050 μl).

Définition de l’unité :
Une unité correspond à la quantité d’enzyme qui catalyse l’hydrolyse de 1 μmol de para-nitrophénylphosphate par minute dans un tampon de glycine (pH 10,4) à 37°C.

Concentration :
1 unité /μl

Test fonctionnel :
Déphosphorylation de plasmides digérés par une enzyme de restriction (5 – 20 pmol des terminaisons 5’, 0,1 - 0,5 unités/pmol des terminaisons 5’). Réduit la religature à < 0,5 % par rapport au contrôle non traité.

PROTOCOLE POUR LA DÉPHOSPHORYLATION DES NUCLÉOTIDES ET LA DÉGRADATION DES AMORCES AVANT LES RÉACTIONS DE SÉQUENCAGE OU LES ANALYSES DE SNP :
Veuillez vous référer au protocole ExoSAP-IT USB, la référence en matière de nettoyage par PCR.

L’achat d’ExoSAP-IT délivre une licence pour exploiter les méthodes de nettoyage d’échantillons de PCR à l’aide d’Exonucléase I et de SAP.

Tampon de réaction 10X SAP testé de manière fonctionnelle (inclus, réf. 70103) :
200 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM MgCl₂.

Tampon de dilution SAP testé de manière fonctionnelle (1 ml inclus, réf. 72761) :
50 mM Tris-HCl (pH 8,0).

Références :
1. RUAN, C. C., SAMOLS, S. B. AND FULLER, C. W. (1990) Comments 17, (No.1), United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH.
2. WERLE, E., SCNEIDER C., RENNER, M., VÖLKER, M. AND FIEHN, W. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4354-4355.
3. HANKE, M. AND WINK, M. (1994) BioTechniques 17, 858-860.

Description de l’article Shrimp Alkaline Phosphatase, 1000 Units, 1 unit/μL Concentration, Tested for Contaminating Endonucleases, Exonucleases, and Ribonucleases